Moderne Methodiken der Molekularbiologie erlauben die Übertragung von artfremden Genen in Kulturpflanzen. In BarMatinTM erfolgte dies mittels der sog. Genfähre Agrobakterium tumefaciens. Das Prinzip dabei ist in nachfolgender Abbildung 1 dargestellt und beschrieben (vgl. dazu Gelvin, (2003) Improving plant genetic engineering by manipulating the host. Trends Biotechnol (21): 95–98). Für die Transformation wurde die Gerstenlinie Golden Promise verwendet, da sich diese besonders gut infizierbar mit Agrobakterium tumefaciens zeigte (vgl. dazu Orman-Ligeza et al., (2020) TRA1: A locus responsible forcontrolling Agrobacterium-mediated transformability in barley. Front Plant Sci (11): 1-11).
Abbildung 1: Prinzip der Integration des Thaumatin-Gens in das Genom der Gerste (roter Abschnitt). Das Gen wurde aus Katamfe isoliert und zusammen mit einem gewebespezifischen Promotor in das Ti-Plasmid eingefügt. Dieses wurde dann in Agrobakterium tumefaciens transformiert und das Bakterium überträgt nach Infektion einer Zelle das Gen an eine zufällige chromosomale Position im Gerstengenom. Die Übertragung ist ein komplexes Zusammenspiel mit den Virulenzgenen der Genfähre. Durch die Co-Transformation des Bar-Herbizid-Resistenzgens konnte eine stringente Selektion von Zellen mit integriertem Thaumatin-Gen durchgeführt werden. Das Thaumatin-Gen in BarMatinTM ist auf Homozygotie hin selektiert worden, sodass es in der Linie dauerhaft erhalten bleibt und sehr einfach vermehrt werden kann.
Das native Thaumatin-Protein hat eine Länge von 207 Aminosäuren und eine Masse von 22 kDa. Die Isoformen I und II haben die gleiche Länge, unterscheiden sich allerdings an vier Aminosäure stellen. Die dreidimensionale Struktur von Thaumatin I besteht aus drei Domänen (i-iii), wobei ii und iii durch eine hohe Anzahl an Disulifbrücken charakterisiert sind, welche dem Protein eine relativehohe Temperaturstabilität verleihen. Insgesamt bildet das Protein acht solcher Disulfidbrücken aus (vgl. dazu De Vos et al., (1985) Three-dimensional structure of thaumatin I, an intensely sweet protein. Proc Natl Acad Sci USA (82): 1406-1409).
Durch die Vorschaltung eines Speicherprotein-Promotors wird sichergestellt, dass BarMatinTM das Thaumatin-Protein gewebespezifisch im Endosperm des Korns akkumuliert. Mit dieser Kombination nutzt man die spezifischen Transkriptionsfaktoren des Endosperms (siehe Abbildung 2) und Thaumatin I wird nicht in anderen Pflanzengeweben wie Blätter, Sprosse oder Wurzel gebildet.
Abbildung 2: Längsschnitt durch ein Gerstenkorn. In BarMatinTM erfolgt die Akkumulation von Thaumatin I ganz spezifisch im Endosperm (Pfeil, blau eingefärbt) des Korns.
Das Protein von BarMatinTM wurde mittels verschiedener Methodologien auf seine Identität hin verifiziert. Z. B. konnte die genomische Integrität und die Transkription (gebildete mRNA) mittels PCR verifiziert werden. Auch auf Proteinebene konnte gezeigt werden, dass BarMatinTM zu 100 % dem Thaumatin I-Protein entspricht (Proteinsequenzierung durch Edman-Abbau). Trennt man das gereinigte Thaumatin-Protein von BarMatinTM elektrophoretisch auf, so ist eindeutig ein Protein von 22 kDa als Bande ersichtlich (siehe Abbildung 3).
Abbildung 3: Unterschiedlich aufgereinigtes Thaumatin I aus BarMatinTM elektrophoretisch mittels Polyacrylamid-Gel getrennt und mit Coomassin-Blau angefärbt. Das aufgereinigte Protein in BarMatinTM (Spur 4,3, 1 und 0,5) entspricht mit 22 kDa exakt der Molekülmasse von Thaumatin I (siehe schwarzer Pfeil). Es lassen sich je kg Körner an BarMatinTM ca. 3 g aufgereinigtes Protein herstellen. Die Proteinkonzentration hängt stark von der Nitratversorgung der Pflanzen ab.
Einen noch eindeutigeren Beweis für die Identität des Thaumatin I-Proteins in BarMatinTM liefern sog. Peptid-Karten von enzymatischen Abbauprodukten, die chromatografisch aufgetrennt werden. Diese sind in BarMatinTM und Katamfe absolut identisch (siehe Abbildung 4).
Abbildung 4: Enzymatische Abbauprodukte von Thaumatin I aus Katamfe (linkes Chromatogramm) und BarMatinTM (rechtes Chromatogramm).
Auch das schlichte Essen eines Korns liefert den Beweis: BarMatinTM bildet Thaumatin I in großen Mengen!
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